Kapiller Elektroforez DNA Sekanslama

Kapiller Elektroforez DNA Sekanslama

Genomik DNA kalıbının hazırlanması

• Genomik DNA Standard yüksek moleküler ağırlıkta DNA izolasyonu protokolüne göre elde edilir.
• Genomik DNA konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle belirlenir.
• Ölçülen konsantrasyon değerine göre, genomic DNA steril, deiyonize su ile ya da 10 mM Tris, pH 8.0 ile dilüe edilir.

İnsan geni için: DNA 30 ile 60 ng/µl arasında olacak şekilde dilüe edilmelidir.

• Dilüe edilen genomik DNA porsiyonlara ayrılıp -15°C/-25°C arasında saklanır.

Not: Tekrarlayan çözdürüp dondurma işleminden uzak durun.

• DNA kalitesi, spektrofotometrede okunan A260 ve A280 değerlerinin oranlanmasıyla bulunur. (A260/A280)

Not: Yüksek kalite DNA, A260/A280 oranı 1.7 ile 1.9 arasında ölçülür.

PCR Amplifikasyonu

PCR Reaksiyonunun Hazırlanması:

Reaksiyon karışımı hazırlanır.

Reaksiyon karışımı hazırlanırken çalışılacak numune sayısı fazla ise ortak kimyasallar-PCR mastır mix,G/C enhancer gibi- tek tüpte mastır mix halinde hazırlanılabilir. Mastır miks için gerekli olan miktar numune sayısına göre hesaplanır ve eşit olarak pcr tüplerine dağıtılır.

Reaksiyona konulacak malzemeler:

• PCR Mastır miks…………..…………….. 12,5 µl

PCR mastır miks içerisinde PCR reaksiyonu için gerekli olan MgCl2, dNTP, Taq Polimeraz ve tampon solüsyonu bulunmaktadır.

• İleri (Forward) Primer………………… 2,5 µl

Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen ileri(forward) primer kullanılır.

• Geri (Reverse)Primer…………………. 2,5 µl

Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen geri (reverse)primer kullanılır.

• G/C Enhancer…………………………….. 5 µl

Genomik DNA dizisine primerlerin bağlanmasını kolaylaştırır.

• Genomik DNA (30-60 µl)……………. 2,5 µl

Tüm kimyasallar eklendikten sonra pcr tüpleri kısaca vortekslenir. Tüm kimyasallar eklendikten sonraki toplam hacim 25 µl olmalıdır.

• PCR tüpleri PCR Termal saykıl cihazına yerleştirilir.
• Termal saykıl cihazına, aktivasyon, amplifikasyon ve elongasyon sıcaklık ve zaman ayarları yapılan deneye bağlı olarak kaydedilir. Aşağıda örnek ayarlar bulunmaktadır:

Aktivasyon: 1 döngü

95°C………………… 10’

Amplifikasyon: 40 döngü

95°C………………… 40’’

62°C………………… 1’

72°C………………… 50’’

Elongasyon: 1 döngü

72°C………………… 7’

Saklama:

4°C………………… ∞

DNA Miktarının Belirlenmesi

PCR reaksiyonu sonrasında ürün DNA miktarını belirlemek için 5 µl PCR ürünü DNAdan alınarak yükleme boyası ile karıştırılır ve önceden hazırlanan %2’lik agaroz jele yüklenir. Jelde boş bırakılan kuyucuklardan birine DNA markırı yüklenir. UV illüminasyon cihazında görüntüleme yapılır.

PCR Ürünlerinin Temizlenmesi

PCR reaksiyonu sonrasında pcr tüpleri, tüp çeperinde kalan olası ürünleri çöktürmek amacıyla kısaca santrifüj yapılır.

• Elde edilen pcr ürününden farklı bir pcr tüpüne 5 µl konulur.
• PCR reaksiyon artıklarını temizleme amacıyla, üzerine 2 µl işleme özgü bir enzim eklenir.
• Toplam hacim 7 µL’dir.
• Hazırlanan tüpler Termal Saykıl’a yerleştirilir ve kullanılan enzim çeşidine bağlı olarak hazırlanan kondisyonlarda cihaz çalıştırılır. Örnek kondisyonlar aşağıdaki gibidir:

Enzim inkübasyonu:

37°C………………… 30’

Enzim deaktivasyonu:

80°C………………… 15’

Saklama:

4°C………………… ∞

Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması

PCR reaksiyon artıklarından temizlenen ürünler sekans reaksiyonu için hazırlanır. Sekans reaksiyonunda kullanılan malzemeler aşağıdaki gibidir:

• Dye Terminator Miks ……………………. 2 µL
• Sekans Tamponu ……………………. 2 µL
• İleri(F) /Geri Primer(R) ……………………. 2 µL
• PCR ürünü ……………………. 2 µL
• Distile Su                         .…………………… 2 µL

Toplam hacim 10 µL’dir. Hazırlanan tüpler kimyasalların karışması için kısaca vortekslenip, santrifüjde çöktürülür ve Termal Saykıl cihazına yerleştirilir. Ornek termal saykıl koşulları aşağıdaki gibidir:

Aktivasyon:

96°C………………… 1’

Saykıl: 25 tekrar

96°C………………… 10’’

50°C………………… 5’’

60°C………………… 4’

Saklama:

4°C………………… ∞

Ekstensiyon ürünlerinin saflaştırılması

Ürünler SEPHADEX’li kolonlar kullanılarak saflaştırılır.

Kolonların hazırlanışı:

• Sephadex’li kolonlara 750 µL ultra saf su eklenir.
• Kolonlar toz Sephadex iyice çözünene kadar vortekslenir.
• Kolonlar 30 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 2 dakika 4600 rpm de santrifüjlenir. Kolon içinde silindir şeklinde matriks gözlenir.
• Kolon konteynerindeki toplanan suyun tamamen boşaltıldığından emin olunur.
• Sekans ürünlerinin tamamı dikkatlice sephadex matriksin merkezine pipetle konulur.
• Kolon tekrar 2 dakika 4600 rpm de santrifüj edilir.

Saflaştırılan ürünün Kapiller Elektroforez Dizi Analizi Cihazına Yüklenmesi

• Kolon konteynerinde toplanan ürünün tamamı 96 kuyucuklu pleyte aktarılır.
• Pleyt Septa ile kapatılır.
• Pleyt cihaza ait olan pleyt tutucuya yerleştirilerek cihaza yerleştirilir.
• Kapiller elektroforez sonrası elde edilen data yorumlanır.