Doku veya Hücre Ekstraktı Hazırlanması:
Doku ekstraktı hazırlanması: Alınan dokulara örnek tamponu eklenerek (50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 μg/mL Aprotinin, 5 μg/mL Leupeptin, 5 μg/mL Pepstatin A) doku ekstraktları hazırlanır.
Hücre ekstraktı hazırlanması: Hücre kültürü gruplarından alınan örneklerin besi ortamı spire edildikten sonra, soğutulmuş PBS ile yıkanır. Üzerine örnek tamponu eklenerek (50 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 5 μg/mL Aprotinin, 5 μg/mL Leupeptin, 5 μg/mL Pepstatin A) hücre ekstraktları hazırlanır.
Protein Ölçümü
SDS-PAGE Jellerinin Hazırlanması
Seçilen konsantrasyondaki ayırıcı jel için monomer karışımı, aşağıdaki tablo izlenerek
hazırlanır.
Ayırıcı (separating) Jel Hazırlanması: 0.375 M Tris, pH 8.8
%5 %7 %10 %12 %15
Saf su 7.5 12,7 mL 10.7 4.65 mL 3.65 mL
3 M Tris-HCl, pH 8.8 1,25 mL 2,5 mL 2,5 mL 1.25 mL 1.25 mL
%20 (w/v) SDS 0.05 mL 0,1 mL 0,1 mL 0.05 mL 0.05 mL
Akrilamid/Bis-akrilamid
(%29.2/%0.8 w/v)
1.15 mL 4,6 mL 6,6 mL 4.0 mL 5.0 mL
%10 (w/v) amonyum persülfat 0.05 mL 0,2 mL 0,2 mL 0.05 mL 0.05 mL
TEMED 0.005 mL 0.02 mL 0,02 mL 0.005 mL 0.005 mL
Total monomer karışımı 10.005 mL 20,12mL 20,12 mL 10.005 mL 10.005 mL
Jel yüzeyi izopropanol ile kaplanır.
45-60 dakika polimerize olması için beklenir.
Jel yüzeyindeki izopropanol dökülür.
Paketleyici (stacking) Jel Hazırlanması: %4.0, 0.125 M Tris, pH 6.8
Saf su 7.35 mL
1.5 M Tris-HCl, pH 6.8 1.25 mL
20% (w/v) SDS 0.05 mL
Akrilamid/Bis-akrilamid (%29.2/%0.8 w/v) 1.34 mL
%10 (w/v) amonyum persülfat 0.04 mL
TEMED 0.1 mL
Toplam monomer karışımı 10.13 mL
Paketleyici jel için monomer karışımı yukarıdaki tablo izlenerek hazırlanır.
Jel tarakları dikkatli bir biçimde polimerize olmamış karışım içine yerleştirilir.
Polimerizasyonun tamamlanması için 45-60 dakika beklenir
D.Örnek Hazırlanması
Protein örnekleri 10-40 μL’de yaklaşık 10-40 μg olacak biçimde, en az 1:4 oranında
örnek tamponu ile karıştırılır.
95 °C’de 2-4 dakika (veya 100 °C’de 1 dakika ) tutulur.
Elektroforetik Yürütme
Örnek yüklendikten hemen sonra sistem kapatılır ve elektrotlar bağlanır.
Örnekler ayırıcı jele girinceye kadar düşük akımda 100 Volt gerilim uygulanır.
Örnek ayırıcı jele geçtikten sonra ise gerilim 150-200 Volt’a çıkarılır.
İlk denemelerde voltaj değişimleri izlenir ve not alınır.
Brom fenol mavisi jelin alt ucuna varınca akım kesilir ve jel tanktan uzaklaştırılır.
Transfer için malzemeler
Tris 30 g
Glisin 144 g
SDS (%10) 20 mL
Distile su 800 mL’ye tamamlanır
Metanol 200 mL eklenir (kullanılacağı zaman) transfer gerçekleştirilir.
Bloklama
Transfer sonrası proteinleri bağlanmış olan membran 1.5 saat %5’lik süt tozu ve %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi (bloklama çözeltisi) içinde çalkalamaya bırakılır.
Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika
süre ile yıkanır.
Birincil antikor ile inkübasyon
Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş birincil antikor ile inkübe edilir. İnkübasyon süresi her antikor için ayrı olarak belirlenmiştir.
Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika süre ile yıkanır.
İ. İkincil antikor ile inkübasyon
Membran bloklama çözeltisi içinde dilüe edilmiş horseradish peroksidaz bağlı ikincil
antikor ile 1 saat oda sıcaklığında inkübe edilir.
Bu süre sonunda membran 3 kez %0.1’lik Tween 20 içeren PBS çözeltisi ile 5 dakika
süre ile yıkanır.
ECL ile görüntüleme
İkincil antikora bağlı bulunan horseradish peroksidaz enzimi, ECL çözeltisi içinde bulunan Lumigen PS-3 substratını katalizler. Bu reaksiyon sonucu açığa çıkan luminol ışımaya yol açar. Bu ışıma, Western blota özel filmler ile saptanır.