Klinik testler, eksize edilmiş domuz veya insan derisi üzerinde OECD yönergesi 428’e göre gerçekleştirilir. Genel olarak hayvan derisi (örneğin sıçan derisi) daha geçirgendir ve bu nedenle insan deri altı absorpsiyonunu olduğundan fazla tahmin edebilir. İzole edilmiş cilt üzerinde in vitro dermal absorbsiyon çalışmalarının kullanımı, epidermisin, özellikle stratum corneum’un, ksenobiyotiklerin vücuda nüfuz etmesine ve alınmasına karşı cildin ana in vivo bariyerini oluşturduğu gerçeğine dayanmaktadır.
Test maddesi, genellikle bir difüzyon hücresine yerleştirilen deri numunesi üzerine uygun bir formülasyonda uygulanır. Difüzyon hücresi bir deri preparasyonu ile ayrılmış bir üst verici ve bir alt alıcı odasından oluşur. Hücreler, tercihen asal, absorbe edici olmayan bir malzemeden yapılır. Alıcı sıvının sıcaklık kontrolü, deney boyunca çok önemlidir. Difüzyon hücresindeki cilt yüzey sıcaklığı, 32 santigrat derecelik klinik cilt sıcaklığında tutulmalıdır. Alıcı sıvı deney boyunca iyice karıştırılır. Alıcı sıvının bileşimi, test maddesinin difüzyon derecesini sınırlamayacak şekilde seçilir, yani test edilen kimyasalın reseptör sıvısındaki çözünürlüğü ve stabilitesi şu şekilde olmalıdır:garantili. Hidrofilik bileşikler için tuzlu su veya tamponlu tuzlu su çözeltileri yaygın olarak kullanılır. Lipofilik moleküller için, serum albümini veya uygun çözücüler/emülgatörler, membran bütünlüğüne müdahale etmeyen miktarlarda ilave edilir. Alıcı sıvıdaki penetran miktarının herhangi bir zamanda doyma seviyesinin %10’undan az olduğundan emin olunmalıdır. Madde, in vitro test ve sonraki analiz süresince alıcı sıvı içinde stabil kalmalıdır.
Hem doz hem de cilt ile temas süresi (maruz kalma), amaçlanan kullanım koşullarını taklit edecek şekilde seçilir. Uygulanacak formülasyon miktarı katı ve yarı katı preparatlar için 2 ile 5 mg/cm2 arasında, sıvılar için ise 10 µl/cm2’ye kadardır. Kullanılan formülasyon hacmi, numuneyi cilt yüzeyine homojen bir şekilde yaymak için yeterli olmalıdır. Bu büyük ölçüde formülasyonun viskozitesine bağlıdır. Maruz kalma süresi ve numune alma süresi protokolde tanımlanmalıdır. Normal maruz kalma süresi 24 saattir. Daha uzun süre, bariyerin bozulmasına neden olabilir ve membran bütünlüğünün dikkatlice kontrol edilmesini gerektirir. Bariyer bütünlüğü bir araç kullanılarak kontrol edilmelidir. Bu, örneğin trityumlu su, kafein veya sakaroz gibi bir işaretleyici molekülün penetrasyonunu ölçerek veya TEWL veya TER ölçümleri gibi fiziksel yöntemlerle elde edilir. Elde edilen veriler raporlanmalıdır. Örnekleme sıklığı, dermal absorpsiyonun hızına/derecesine bağlıdır. Uygun analitik teknikler, örneğin sintilasyon sayımı, HPLC veya GC kullanılmalıdır. Geçerlilikleri, duyarlılıkları ve tespit limitleri raporda belgelenmelidir. Duyarlılıkta bir artış gerektiğinde, test maddesi mümkün olduğunda radyo-etiketlenmelidir. Mikrootoradyografi gibi kalitatif veya yarı kantitatif yöntemler cilt dağılımı değerlendirmeleri için faydalı araçlar olabilir. Test bileşiğinin miktarları (SCCNFP/0750/03) şu kapsamlar içinde belirlenmelidir:
• ciltteki fazlalık,
• stratum corneum (örneğin yapışkan bant şeritleri),
• stratum corneum’suz epidermis,
• dermiş
• reseptör sıvısı.
Uygulanan dozun kütle dengesi belirlenmelidir. Test maddesinin (metabolitleri dahil) genel geri kazanımı %85-115 aralığında olmalıdır. Test maddesinden daha düşük geri kazanımlar elde edilirse, nedenlerinin araştırılması ve açıklanması gerekir. Ekipmanda madde absorbsiyonu kontrol edilmelidir. Dermal absorbsiyon çalışmalarının sonuçları, mutlak miktar (deri yüzeyinin µg/cm2’si) ve içinde bulunan test maddesi miktarının yüzdesi olarak ifade edilmelidir. Cilt yüzeyinin santimetre karesi başına uygulanan amaçlanan doz, alıcı sıvıda bulunan penetre edilmiş madde miktarlarının, sistematik olarak mevcut olduğu kabul edilir. Epidermis (stratum corneum hariç) ve dermis bir lavabo olarak kabul edilir, bu nedenle bu dokularda bulunan miktarlar eşit olarak emilmiş olarak kabul edilir ve alıcı sıvıda bulunanlara eklenir. Örnekleme sırasında stratum corneum tarafından tutulan miktarlar dermal olarak absorbe edilmez ve bu nedenle sistemik doza katkıda bulunmazlar. Absorbsiyon hızı ve kütle dengesi, her bir difüzyon hücresi için ayrı ayrı hesaplanmalıdır. Ancak o zaman, ortalama +/- SD hesaplanabilir.